1. Общие положения и область применения

1.1 . Настоящие методические рекомендации устанавливают методы лабораторных испытаний качества парфюмерно-косметической продукции по микробиологическим показателям безопасности в соответствии с СанПиН 1.2.681-97 «Производство и контроль парфюмерно-косметической продукции для обеспечения ее безопасности и качества».

1.2 . Настоящие методические рекомендации разработаны в связи с необходимостью усовершенствования методов микробиологического анализа парфюмерно-косметической продукции с использованием зарубежных питательных сред, в целях гармонизации национальных методов исследования с современными международными стандартами, рекомендованными ИСО.

1.3 . Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль парфюмерно-косметической продукции; в лабораториях учреждений Роспотребнадзора, а также в испытательных лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения испытаний указанной продукции.

2. Нормативные ссылки

2.1 . СанПиН 1.2.681-97 «Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции».

2.2 . СП 1.2.731-99 Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами.

2.3 . МУК 4.2.801-99 «Методы микробиологического контроля парфюмерно-косметической продукции».

2.4 . ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических анализов».

2.5 . ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

2.6 . ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».

2.7 . ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

2.8 . ГОСТ 29188.0-91 «Парфюмерно-косметические изделия. Правила приемки, отбор проб, методы органолептических испытаний».

2.9 . ГОСТ 10444.15-94 «Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов».

2.10 . ГОСТ 10444.2-94 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus».

2.11 . ГОСТ 10444.12-88 «Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов».

2.12 . ГОСТ 29184-91 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий семейства Enterobacteriaceae».

2.13 . Microbiological Methods for Cosmetics. Bacteriological Analytical Manual, U.S.FDA, 2001. — Микробиологические методы исследования парфюмерно-косметической продукции. Руководство по бактериологии. (U.S.FDA — Американская организация по контролю продуктов и лекарств) — 2001 г.

2.14 . Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria, ISO/CD 21149, 2003 — Определение и подсчет мезофильных аэробных бактерий в образцах парфюмерно-косметической продукции, проект ИСО 21149, 2003.

2.15 . Cosmetics — Microbiology — General guidance for the enumeration of yeasts and moulds , ISO/CD 16212, 2003 — Общее руководство по подсчету дрожжеподобных и плесневых грибов в образцах парфюмерно-косметической продукции, проект ИСО 16212, 2003.

2.16 . Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli, ISO/DIS 21150, 2004 — Определение Escherichia coli в образцах парфюмерно-косметической продукции, проект ИСО 21150, 2004.

2.17 . Cosmetics — Microbiology — Detection of Pseudomonas aeruginosa, ISO/CD 22717, 2003 — Определение Pseudomonas aeruginosa в образцах парфюмерно-косметической продукции, проект ИСО 22717, 2003.

2.18 . Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus, ISO/CD 22718, 2004 — Определение Staphylococcus aureus в образцах парфюмерно-косметической продукции, проект ИСО 22718, 2004.

3. Требования к помещениям и технике безопасности

Требования безопасности, общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура должны соответствовать требованиям СП 1.2.731, ГОСТ Р 51446.

4. Преимущества использования питательных сред производства Merck KGaA для исследования парфюмерно-косметической продукции

Для целей настоящих MP при проведении микробиологических исследований парфюмерно-косметической продукции применяются питательные среды, рекомендованные международными нормативными документами (п.п. 2.13 — 2.18).

В качестве среды для приготовления исходного и последующих разведений применяется казеино-пептонный бульон с твином 4 % и лецитином (ТАТ-бульон). Совместное действие твина и лецитина инактивирует антимикробные вещества, входящие в состав парфюмерно-косметической продукции. Предлагаемая среда является универсальной как для водорастворимых образцов, так и для эмульсий типа масло-вода.

Для этапа неселективного обогащения бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus используется летиновый бульон. Высокое содержание в среде пептонов из мяса и казеина, дрожжевой экстракт обеспечивают оптимальные условия для прорастания спор и восстановления поврежденных клеток микроорганизмов. Среда является универсальной для накопления всех микроорганизмов, регламентированных СанПиН 1.2.681.

5. Отбор проб

Отбор проб проводят по ГОСТ 29188.0, ГОСТ 26668, МУК 4.2.801.

6. Подготовка проб

6.1 . Подготовка проб к анализу по ГОСТ 26669 , МУК 4.2.801.

6.2 . Исходное разведение исследуемого образца средней пробы (в т.ч. эмульсии типа вода-масло), приготовленной по МУК 4.2.801, и при необходимости ряд десятикратных разведений проводят по ГОСТ 26669 и МУК 4.2.801 в казеино-пептонном бульоне с лецитином и твином 20 (ТАТ-бульон) (п. 8.2.1 ), тщательно перемешивают и встряхивают 15 — 30 мин до полной однородности.

7. Проведение испытаний *

7.1. Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)

* Схема микробиологического контроля парфюмерно-косметической продукции приведена в Приложении № 1.

Метод основан на выявлении и подсчете всех выросших колоний микроорганизмов на агаризованной питательной среде при температуре (30 ± 1) °С в течение (72 ± 3) ч и пересчете их количества на 1 г (см 3 ) исследуемого продукта.

7.1.2.1 . По 1 см 3 исходного разведения образца (или разведения, при посеве которого на чашках вырастают не менее 30 и не более 300 колоний), приготовленного по 6.2 , внести в две параллельные чашки Петри для каждого разведения.

Испытания проводят глубинным агаровым методом.

При посеве использовать одну из сред: летиновый агар (п. 8.2.2) или триптиказо-соевый агар с твином и лецитином (п. 8.2.3).

Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посевы глубинным агаровым методом проводят по ГОСТ 26670 и МУК 4.2.801.

7.1.2.2 . Посевы инкубировать при температуре (30 ± 1) °С в течение (72 ± 3) ч.

7.1.2.3 . Обработка результатов по ГОСТ 26670 и МУК 4.2.801.

7.2. Определение количества дрожжей и плесневых грибов

Метод основан на выявлении и подсчете колоний дрожжей и плесневых грибов, выросших на селективных агаризованных питательных средах при температуре (24 ± 1) °С в течение (120 ± 3) ч и пересчете их количества на 1 г (см 3 ) исследуемого продукта.

7.2.2.1 . По 1 см 3 исходного разведения образца (или разведения, при посеве которого на чашках вырастают не менее 15 и не более 150 колоний) приготовленного по п. 6.2 внести в две параллельные чашки Петри для каждого разведения.

Испытания проводят глубинным агаровым методом.

При посеве использовать одну из сред: агар Сабуро (п. 8.2.4), картофельно-глюкозный агар (п. 8.2.5) или агар с солодовым экстрактом (п. 8.2.6).

Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посевы глубинным агаровым методом провести по ГОСТ 26670 и МУК 4.2.801.

7.2.2.2 . Посевы инкубировать при температуре (24 ± 1) °С в течение (72 — 120 ± 3) ч. с предварительным учетом типичных колоний через (72 ± 3) ч.

Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем.

Плесневые грибы образуют плоские или пушистые разрастающиеся колонии.

7.2.2.3 . Наличие на средах колоний характерных для дрожжей и плесневых грибов подтверждается микроскопированием.

7.2.2.4 . Обработка результатов по ГОСТ 10444.12 и МУК 4.2.801.

7.3. Неселективное обогащение бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

7.3.1 . 10 см 3 исследуемого образца из разведения 10 -1 , приготовленного по п. 6.2 , внести в 90 см 3 летинового бульона (п. 8.2.7 ).

7.3.2 . Посевы инкубировать при температуре (36 ± 1) °С в течение (24 — 48 ± 3) ч.

7.4. Выявление и идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae

Метод основан на выявлении бактерий семейства Enterobacteriaceae с использованием неселективного накопительного бульона и селективных агаровых питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий.

7.4.2.1 . При наличии признаков роста культуру, полученную после инкубирования по п. 7.3.2 пересеять на одну из агаризованных селективно-диагностических сред: Мак-Конки агар (п. 8.2.8 ) или агар с глюкозой, кристаллическим фиолетовым и желчью (VRBD) (п. 8.2.9 ).

7.4.2.2 . Посевы инкубировать при температуре (36 ± 1) °С в течение (24 ± 3) ч.

7.4.2.3 . После инкубирования посевов отмечают рост колоний, характерных для семейства Enterobacteriaceae.

На среде Мак-Конки бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют колонии бесцветные, розовые или красные, окруженные зоной преципитации. На среде VRBD бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют красные колонии, окруженные зоной преципитации.

7.4.2.4 . При наличии на средах колоний характерных для бактерий семейства Enterobacteriaceae дальнейшую идентификацию и обработку результатов проводят по ГОСТ 29184 и МУК 4.2.801.

7.5. Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa

Метод основан на выявлении бактерий Pseudomonas aeruginosa с использованием неселективного накопительного бульона и селективных агаровых питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий.

7.5.2.1 . При наличии признаков роста культуру, полученную после инкубирования по (п. 7.3.2 ), пересеять на цетримидный агар (п. 8.2.10 ).

7.5.2.2 . Посевы инкубировать при температуре (36 ± 1) °С в течение (24 — 48 ± 3) ч.

7.5.2.3 . После инкубирования посевов отмечают рост колоний, характерных для Pseudomonas aeruginosa.

На среде цетримидный агар Pseudomonas aeruginosa образует колонии с желто-зеленым пигментом (пиоцианин), флюоресцирующим в УФ-свете.

7.5.2.4 . При наличии на средах колоний характерных для Pseudomonas aeruginosa дальнейшую идентификацию проводить по МУК 4.2.801.

7.6. Выявление и идентификация Staphylococcus aureus

Метод основан на выявлении бактерий вида Staphylococcus aureus с использованием неселективного накопительного бульона и селективных агаровых питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий.

7.6.2.1 . При наличии признаков роста культуру, полученную после инкубирования по (п. 7.3.2 ) пересеять на одну из селективно-диагностических агаризованных сред: агар Байрд-Паркера (п. 8.2.11 ) или маннит-солевой агар (п. 8.2.12 ).

Посевы инкубировать при температуре (36 ± 1) °С в течение (24 — 48 ± 3) ч.

7.6.2.2 . После инкубирования посевов отмечают рост колоний, характерных для Staphylococcus aureus.

На среде Байрд-Паркер Staphylococcus aureus образует мелкие черные блестящие колонии, окруженные зоной лецитиназной активности.

На маннит-солевом агаре — маннитположительные колонии, окруженные яркой желтой зоной.

7.6.2.3 . При наличии на средах колоний характерных для Staphylococcus aureus дальнейшую идентификацию проводить по ГОСТ 10444.2 и МУК 4.2.801.

8. Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды

8.1 . Аппаратура, материалы и реактивы по МУК 4.2.801.

8.2 . Состав, приготовление и условия хранения питательных сред

Среда для приготовления разведений

8.2.1 . ТАТ-бульон (казеино-пептонный бульон

с лецитином и твином ® 20) — Merck,

C asein-peptone Lecithin Polysorbate Broth (TAT-Broth) Cat. № 1.11723.0500

Пептон из казеина (панкреатический гидролизат казеина) 20,0 г

Соевый лецитин 5,0 г

Твин ® 20 40,0 мл

Дистиллированная вода 960,0 мл

Растворить 25 г сухой среды в 960 мл дистиллированной воды, нагреть на водяной бане при 50 °С в течение 30 мин до полного растворения. Добавить 40 мл твина-20 и автоклавировать 15 мин при 121 °С. рН 7,1 ± 0,2 при 25 °С. Готовая среда прозрачная, желтоватого цвета, слабая опалесценция может возникнуть благодаря присутствию лецитина.

Среду хранить в соответствии с инструкциями производителя.

Среды для культивирования аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

8.2.2 . Летиновый агар (модифицированный) — Merck,

L etheen Agar modified Cat. № 1.10404.0500

Пептон из мяса 10,0 г

Пептон из казеина 10,0 г

Мясной экстракт 3,0 г

Дрожжевой экстракт 2,0 г

Хлорид натрия 5,0 г

Бисульфит натрия 0,1 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Растворить 52,1 г сухой среды и 7 мл твин ® -80 в 1 л дистиллированной воды, подогревая при необходимости и периодически перемешивая; прокипятить 1 мин; автоклавировать 15 мин при 121 °С. рН 7,2 ± 0,2 при 25 °С. Среда в чашках мутная, коричневого цвета.

Среду хранить в холодильнике при температуре (2 — 4 °С). Срок годности готовой среды — 3 недели.

8.2.3 . Триптиказо-соевый агар с твином и лецитином — Merck,

Tryptic Soy Agar with Polysorbate 80 and Lecithin Cat. № 1.07324.0500

Пептон из казеина 15,0 г

Пептон из сои 5,0 г

Хлорид натрия 5,0 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Растворить 45,7 г сухой среды в 1 литре дистиллированной воды, подогреть, если необходимо довести до кипения, перемешивать до полного растворения. Автоклавировать 15 мин при 121 °С. рН 7,3 ± 0,2 при 25 °С. Готовая среда в чашках прозрачная, желтовато-коричневая.

Среду хранить в холодильнике при температуре (2 — 4 °С). Срок годности готовой среды — 3 недели.

Среды для выращивания дрожжей, дрожжеподобных и плесневых грибов

8.2.4 . Агар Сабуро (4 % глюкозы) — Merck,

Sabouraud-4 % Dextrose Agar Cat. № 1.05438.0500

Дистиллированная вода 1000 мл

Растворить 65 г сухой среды в 1 л дистиллированной воды, автоклавировать 15 мин при 121 °С. Не перегревать. рН 5,6 ± 0,2 при 25 °С. Среда прозрачная, желтовато-коричневая.

Среду хранить в холодильнике при температуре (2 — 4 °С). Срок годности готовой среды — 3 недели.

8.2.5 . Картофельно-глюкозный агар — Merck,

Potato Dextrose Agar Cat. № 1.10130.0500

Картофельный отвар 4,0 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Растворить 39 г сухой среды в 1 л дистиллированной воды, автоклавировать 15 мин при 121 °С. рН: 5,6 ± 0,2 при 25 °C. Среда прозрачная, желтовато-коричневого цвета. Повторно расплавлять среду не рекомендуется.

Среду готовить непосредственно перед использованием.

8.2.6 . Агар с солодовым экстрактом — Merck,

M alt Extract Agar Cat. № 1.05398.0500

Солодовый экстракт 30,0 г

Пептон из сои 3,0 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Растворить 48 г сухой среды в 1 л дистиллированной воды, автоклавировать в мягком режиме (10 мин при 121 °С), не перегревать. рН 5,6 ± 0,2 при 25 °С. Среда прозрачная, желтовато-коричневого цвета. Следует избегать повторного нагревания.

Среду готовить непосредственно перед использованием.

Среда для неселективного обогащения

8.2.7 . Летиновый бульон (модифицированный) Merck,

L etheen Broth modified Cat. № 1.10405.0500

Пептон из мяса 20,0 г

Пептон из козеина 5,0 г

Мясной экстракт 5,0 г

Дрожжевой экстракт 2,0 г

Хлорид натрия 5,0 г

Биосульфит натрия 0,1 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Растворить 37,8 г сухой среды и 5 мл твина-80 в 1 л дистиллированной воды. При необходимости подогреть при периодическом перемешивании до полного растворения; автоклавировать 15 мин при 121 °С. рН 7,2 ± 0,2 при 25 °С. Готовая среда мутная, желтовато-коричневого цвета.

Среду хранить в соответствии с инструкциями производителя.

Среды для культивирования бактерий семейства Enterobacteriaceae

M acConkey Agar Cat. № 1.05465.0500

Пептон из мяса 3,0 г

Пептон из козеина 17,0 г

Смесь солей желчных кислот 1,5 г

Хлорид натрия 5,0 г

Нейтральный красный 0,003 г

Кристаллический фиолетовый 0,001 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Растворить 50 г сухой в 1 л дистиллированной воды, автоклавировать 15 мин при 121 °С. рН 7,4 ± 0,2 при 25 °С. Среда в чашках прозрачная, от красно-коричневого до темно-красного цвета.

Для предотвращения от высыхания поместить чашки со средой в пластиковые мешки.

Чашки со средой хранить в холодильнике при температуре (2 — 4 °С). Срок годности готовой среды на чашках — 3 недели.

8.2.9 . Агар с глюкозой, кристаллическим фиолетовым Merck

и желчью (VRBD) — VRBD (Violet Red Bile Dextrose) Agar Cat. № 1.10275.0500

Пептон из мяса 7,0 г

Дрожжевой экстракт 3,0 г

Смесь солей желчных кислот 1,5 г

Хлорид натрия 5,0 г

Нейтральный красный 0,03 г

Кристаллический фиолетовый 0,002 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Растворить 39,5 г сухой среды в 1 л дистиллированный воды и нагревать при частом перемешивании до полного растворения. После этого кипятить не более 2 мин. Среду нельзя автоклавировать или перегревать! рН 7,3 ± 0,2 при 25 °С. Готовая среда прозрачная, темно-красного цвета.

Для предотвращения от высыхания поместить чашки со средой в пластиковые мешки.

Чашки со средой хранить в холодильнике при температуре (2 — 4 °С). Срок годности готовой среды на чашках — 3 недели.

Среда для культивирования Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas Selective Agar (Cetrimide Agar) Cat. № 1.05284.0500

Пептон из желатина 20,0 г

Хлорид магния 1,4 г

N-цетил-N,N,N-триметиламмониумбромид (цетримид) 0,3 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Растворить 44,5 г сухой среды в 1 л дистиллированный воды, добавить 10 мл глицерина, автоклавировать 15 мин. при 121 °С, разлить в чашки. рН 7,0 ± 0,2 при 25 °С. Среда в чашках мутная, светло-коричневая.

Для предотвращения от высыхания поместить чашки со средой в пластиковые мешки.

Чашки со средой хранить в холодильнике при температуре (2 — 4 °С). Срок годности готовой среды на чашках — 3 недели.

Среды для культивирования Staphylococcus aureus

8.2.11 . Агар Байрд-Паркср (Селективный агар для

Baird-Parker Agar Cat. № 1.05406.0500

Пептон из козеина 10,0 г

Мясной экстракт 5,0 г

Дрожжевой экстракт 1,0 г

Пируват натрия 10,0 г

Желточно-теллуритная эмульсия 50,0 мл

Дистиллированная вода 950 мл

Растворить 58 г сухой среды в 950 мл дистиллированный воды, автоклавировать 15 мин. При 121 °С, охладить до 45 — 50 °С, смешать с 50 мл желточно-теллуритной эмульсии. Разлить в чашки. рН 6,8 ± 0,2 при 25 °С. Среда в чашках опалесцирующая, желтовато-коричневого цвета.

Для предотвращения от высыхания поместить чашки со средой в пластиковые мешки.

Чашки со средой хранить в холодильнике при температуре (2 — 4 °С). Срок годности готовой среды на чашках — 3 недели.

M annitol Salt Phenol-red Agar Cat. № 1.05404.0500

Мясной экстракт 1,0 г

Хлорид натрия 75,0 г

Феноловый красный 0,025 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Растворить 108 г сухой среды в 1 я дистиллированный воды, автоклавировать 15 мин. при 121 °С. Разлить в чашки, рН 7,4 ± 0,2 при 25 °С. Среда в чашках прозрачная, красного цвета. Для предотвращения от высыхания поместить чашки со средой в пластиковые мешки.

Чашки со средой хранить в холодильнике при температуре (2 — 4 °С). Срок годности готовой среды на чашках — 3 недели.

Приложение № 1

Схема микробиологического контроля парфюмерно-косметической продукции с использованием питательных сред производства Merck KGaA (Германия)